Blue Genes

Die Grundlagen

Der Bauplan aller Lebewesen, ob Pflanzen, Tiere oder Bakterien ist in den Genen (informationstragende Abschnitte auf der DNA) festgelegt. Sie tragen alle Informationen, die zur Funktion eines Organismus notwendig sind. Entsprechend der in den Genen verschlüsselten Anleitung werden Proteine synthetisiert, die z.B. den Stoffwechsel betreiben, wie etwa Enzyme oder Hormone. Die genetische Information ist in allen Organismen in der gleichen universellen ”Sprache” niedergeschrieben: dem genetischen Code. Er besteht in der Abfolge der Nukleotide, die sich jeweils nur im informationstragenden Teil, den Basen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin unterscheiden, symbolisiert durch die vier Buchstaben A, C, G und T. Je drei Nukleotide bilden ein ”Wort”, auch Codon genannt, das für eine der natürlicherweise in Organismen vorkommenden 20 Aminosäuren steht. Ein Gen liefert auf diese Weise den Bauplan für die Synthese eines bestimmten Proteins (siehe Abbildung 1). Bei der Umsetzung dieser Information wird zunächst eine RNA-Kopie des Gens angefertigt (Transkription). Die Nukleotidsequenz der RNA wird im zweiten Schritt als Abfolge von Tripletts bzw. Codons in die Abfolge von Aminosäuren übersetzt (Translation). Der Fluß der genetischen Information in einer Zelle ist also in der Regel DNA RNA Protein.

Der genetische Code: Alphabet des Lebens        Klonierung von DNA-Fragmenten

Die Abbildungen zeigen Beispiele aus der Folienserie 20 des VCI

Geburtsstunde der Gentechnik 1972 gelang es Paul Berg an der Stanford University of California, San Francisco, erstmals, DNA-Fragmente aus dem viralen SV40 Chromosom mit Plasmid-DNA aus E. coli zu einem neukombinierten DNA-Molekül zu verknüpfen. Er verwendete dabei die aus E. coli stammende Restriktionsendonuklease Eco RI, die sowohl das SV40-Chromosom als auch die Plasmid-DNA jeweils an einer bestimmten Stelle durchtrennt. Die beim Schneiden entstandenen ”sticky ends” der beiden DNA-Moleküle konnten sich aufgrund der Basenkomplementarität zusammenlagern.

Ein weiteres aus Bakterien gewonnenes Enzym, die DNA-Ligase, setzte Berg ein, um die neukombinierten, nur durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehaltenen DNA-Moleküle, kovalent, durch Phosphodiesterbindungen, zu verknüpfen. Somit war es zum ersten Mal gelungen, DNA-Moleküle unterschiedlichen Ursprungs in vitro, d.h. im Reaktionsgefäß, zu verknüpfen. Der Transfer und die Expression neukombinierter DNA-Moleküle in Bakterien gelang schließlich 1973 (siehe Abbildung 2). Stanley Cohen, Herbert Boyer und Annie Chang (Stanford University of California, San Francisco) benutzten in ihrem Experiment ein Plasmid aus E. coli mit dem Namen pSC101 (SC steht für Stanley Cohen).

Es wies die folgenden Eigenschaften auf:

  1. eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Eco RI
  2. einen Replikationsursprung (ori), der die Replikation in der Wirtszelle ermöglichte
  3. ein Gen für die Tetracyclinresistenz, die Voraussetzung für die Selektion der ein Plasmid tragenden Bakterien.

Das von Cohen, Boyer und Chang durchgeführte gentechnische Experiment hatte zum Ziel, die Antibiotikaresistenz für Kanamycin mit Hilfe des Plasmids pSC101 zu übertragen. Dabei wurde das Plasmid pSC101 wie auch das Kanamycinresistenz-Gen-tragende Plasmid pSC102 mit dem Enzym Eco RI geschnitten und die entstandenen DNA-Fragmente zusammengebracht. Ein Teil der linearisierten pSC101 Plasmide hybridisierte dabei mit DNA-Fragmenten, die das Kanamycinresistenz-Gen trugen.

Die nach dem Vorbild Paul Bergs eingesetzte Ligase katalysierte die kovalente Phosphodiesterbindung, so daß ein intaktes neukombiniertes Plasmid entstand. Danach transferierten Cohen, Boyer und Chang die Plasmide nach einer von ihnen entwickelten Methode in E. coli-Zellen. Zur Selektion der Bakterien, welche die neukombinierten Plasmide aufgenommen hatten, ließen sie die E. coli-Zellen auf einem Nährboden mit Tetracyclin und Kanamycin wachsen. Das Wachstum von Kolonien mit Tetracyclin/ Kanamycin-Doppelresistenz bestätigte den erfolgreichen Transfer des neukombinierten (rekombinierten) Plasmids sowie die Ausprägung der neuen Eigenschaften in lebenden E. coli-Zellen. Alle molekularbiologischen Werkzeuge, Plasmide, Restriktionsenzyme und Ligasen, die bei diesen Experimenten eingesetzt wurden, sind natürlichen Ursprungs.

Auch heute noch werden in der Gentechnik die gleichen Grundoperationen durchgeführt wie bei diesem ersten gentechnischen Experiment:

  1. Schneiden der DNA mit Restriktionsenzymen
  2. Einbau der DNA in ein Vehikel (z.B. Plasmide)
  3. Einschleusen der neukombinierten DNA-Moleküle in lebende Zellen
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