Blue Genes

Fragen und Antworten

Da sich im Laufe der Einführungsphase des "Blue Genes" -Genbaukastens bei einzelnen Anwendern Fragen bezüglich einiger Arbeitsschritte ergeben haben, möchten wir hier jene Fragen vorstellen und beantworten, die sicher auch andere Anwender interessieren.

Diese Seite soll ein Kommunikationsforum zwischen uns, den Entwicklern des Genbaukastens und Ihnen den Anwendern sei. Wenn Sie weitere Fragen, Anregungen und Kommentare haben, freuen wir uns über eine e-mail von Ihnen.

Die folgenden Fragen sollen als Grundlage und Anregung dienen.

F: Wie lange lassen sich Agarplatten vor Versuchsbeginn lagern ?
A: Agarplatten, die vor Versuchsbeginn gegossen und im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt werden sollen, müssen einzeln mit Parafilm, bzw. Tesafilm, oder im Stapel mit Frischhaltefolie Luftdicht verschlossen werden, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. Die Platten können dann für mehrere Tage, bishin zu einer Woche gelagert werden. Achten Sie besonders auf sterile Bedingungen um Kontaminationen mit Pilzsporen zu vermeiden und auf eine Lagerung mit dem Deckel nach unten.

F: Kann man den TBE-Elektrophoresepuffer noch verwenden, wenn sich am Boden der Flasche Kristalle gebildet haben ?
A: Nach längerer Lagerung des TBE-Puffers kann es passieren, daß sich Kristalle bilden, die jedoch nach Aufkochen des Puffers wieder in Lösung gehen. Hierzu kann der Puffer entweder in der Mikrowelle oder im Wasserbad auf ca. 100°C erhitzt werden. Nach Verdünnung der Stammlösung, zu einem 1fach konzentrierten Laufpuffer, tritt die Kristallbildung auch nicht mehr auf.

F: Wie kann ich die Arbeitsgeräte sterilisieren ?
A: Trocken-Sterilisation: 1 Stunde bei 180°C
Nur bei Glas oder Metallgegenständen anwenden, da Kunststoffe schmelzen würden. 
Feucht-Sterilisation: Bei 1 barü und 120°C für 20 Minuten bei der Herstellung der Nährlösungen und Wasser bis 1 l Volumen. Ebenfalls anwendbar bei Gefäßen und Geräten aus hitzeresistentem Kunststoff sowie bei der Abtötung von biologischem Material, z.B. Abtöten von Fest- und Flüssigkulturen nach Versuchsende.

F: Wieviele Teilnehmer sollten die Versuchsgruppen idealerweise haben ?
A: Der Praktikumsteil "Analyse von DNA" ist für bis zu 12 Gruppen, bei einer Gruppengröße von 2-4 Teilnehmern, ausgelegt. Dieser Versuchsteil kann jedoch auch als Demonstrationsversuch vor einer größeren Gruppe vorgeführt werden.
Der Praktikumsteil "Klonierung von DNA"  kann mit 4 bis 5 Gruppen zu 2-4 Personen durchgeführt werden.

F: Kann man kompetente Zellen auch selbst herstellen?
A: Herstellen von CaCl 2 kompetenten Zellen

Vorbereitungen vor Beginn des Kurses:

Am Tag vorher wurden von Starterplatten mit den Bakterienstämme E.coli DH5 á eine Einzelkolonie mit einer gelben Spitze abgenommen und in 5 ml LB-Medium angeimpft. Anschießend wurde über Nacht bei 37°C gerollert bzw.geschüttelt. Gegen 8 Uhr des Kurstages wurden diese Übernachtkulturen im Verhältnis 1 : 10 mit LB-Medium verdünnt (3 ml ÜNK in 27 ml frisches LB-Medium geben.) und jetzt 1 bis 2 Stunden bei 37 °C gerollert bzw. geschüttelt.

Versuchsdurchführung:

Es werden insgesamt etwa 30 mal ca. 1 ml Bakterienkultur auf 1,5 ml Eppendorfgefäße verteilt. Dabei übernimmt jede Gruppe 4 Eppendorfgefäße. Die Gruppen kontrollieren ihren Arbeitsplatz: Eis vorhanden? 70 mM CaCl 2 -Lösung auf Eis? Eppendorfgefäße beschriftet? Autoklavierbeutel vorhanden?

    • Verteilung von je 1 ml Bakterienkultur. Eindeutig beschriften (Gruppennummer!
    • dann 5 min auf Eis stellen
    • zentrifugieren bei 5000 rpm für 4 min
    • Überstand vorsichtig in die Autoklavierbeutel abkippen
    • 100µL eiskalte 70 mM CaCl 2-Lösung zugeben, Zellen vorsichtig durch Auf- und Abziehen mit der Variopipette suspendieren
    • 15 min auf Eis
    • 4 min bei 5000 rpm
    • Überstand vorsichtig mit der Pipette abnehmen
    • 100µL eiskalte 70 mM CaCl 2-Lösung zugeben, Zellen vorsichtig suspendieren
    • 20 min auf Eis

Transformation

Sie haben nun 4 mal 100 µL kompetente Zellen. Einmal 100 µL werden für den Ligationsansatz benötigt. Einmal 100 µL dienen zur positiven Kontrolle mit Plasmid DNA.

Text von: Dr. Dietmar Scherr,
Max-Beckmann-Schule, Frankfurt/Main

F: Haben Sie Vorschläge für die Zeiteinteilung?
A: Beispiel Zeiteinteilung im Unterricht
Helene Lange Gymnasium, Dortmund
Jürgen Reckermann

F: Welche Labormaterialien brauche ich noch für die Experimente?
A: Diese Materialien sollten Sie für die Durchführung des Blue Genes Experiments zur Verfügung haben (Exklusive der Materialien aus dem Blue Genes Koffer, des Blue Genes Reagenziensets und der kompetenten e. Coli Zellen)

  • Destilliertes Wasser
  • Ethanol
  • 1 Bunsenbrenner
  • 1 Erlenmaier- Kolben ( 100 ml )
  • 1 Erlenmaier – Kolben ( 500 ml )
  • 1 Messzylinder ( 100 ml )
  • 1 braune Glasflasche ( 1 bis 2 Liter Volumen )
  • 1 Dampfdrucktopf ( 6 Liter Volumen ) oder eine Mikrowelle ( zum Autoklavieren )
  • 1 Wasserbad ( bis 37°C )
  • 1 Brutschrank ( bis 37°C )
  • 1 Zentrifuge für Eppendorf Gefäße ( optional )
  • 1 Labor-Waage
  • 10 Pasteur (Glas) Pipetten ( lang )
  • 1 Stoppuhr
  • 1 Kühlschrank mit *** Gefrierfach
  • 1 isolierter Behälter für Eis
  • Eis
  • Aluminium-Folie
  • Frischhalte-Folie
  • Schutzbrillen
  • Laborkittel
  • Einweghandschuhe
  • Filzschreiber, welche auf Plastikmaterial schreiben

F: Gibt es Beispiele von Anwendern?

A: Ja, z.B. das Teletta-Groß-Gymnasium in Leer

 

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